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梯度PCR仪常见问题及现场解决方案

  梯度PCR仪常见问题及现场解决方案如下:
  
  1、梯度PCR仪在产物序列中引入了错误,这大多是由于聚合酶忠实性低或者循环数太多,这时需要使用带有校正活性的热稳定聚合酶,同时降低循环数。此外,四种dNTP的浓度不同也会出现该问题,此时应制备新的浓度相同的dNTP混合物。
  
  2、PCR跑胶,目的条带很亮,但是边沿不清楚,前后有拖尾现象。出现这样的问题,则需要进行细致的分析,因为引起该问题的可能很多。可先检查是否模板质量问题,如有降解等,模板应避免反复冻融。也有可能是抽提RNA时有污染,则需要重新抽提RNA。此外,也可能是非特异性扩增引发该问题,可提高退火温度,少循环次数。电泳缓冲液时间太长,ph值和盐离子浓度明显改变、电泳时电压太高、电泳液过久没换,电泳胶脏了等都可能引发该问题。如果不是由上述原因引起,则进一步检查加样量是否过大,制胶过程中胶孔是否制好,EB是否冲洗干净、模板中是否混有基因组DNA或蛋白等。也需考虑是否扩增的条件不合适。针对具体原因再采取相应的措施。
  
  3、梯度PCR仪产物何时需要用凝胶纯化,何时不需要?当凝胶分析扩增产物只有一条带时,则不需要使用凝胶纯化。当可见其他杂带时,则可能是积累了大量引物的二聚体,在克隆前需要做凝胶纯化。
  

  以上是关于梯度PCR仪常见问题及现场解决方案的介绍。

 

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  • 梯度PCR仪常见问题及现场解决方案
  • 发布时间:2016-03-08 00:00
  •   梯度PCR仪常见问题及现场解决方案如下:
      
      1、梯度PCR仪在产物序列中引入了错误,这大多是由于聚合酶忠实性低或者循环数太多,这时需要使用带有校正活性的热稳定聚合酶,同时降低循环数。此外,四种dNTP的浓度不同也会出现该问题,此时应制备新的浓度相同的dNTP混合物。
      
      2、PCR跑胶,目的条带很亮,但是边沿不清楚,前后有拖尾现象。出现这样的问题,则需要进行细致的分析,因为引起该问题的可能很多。可先检查是否模板质量问题,如有降解等,模板应避免反复冻融。也有可能是抽提RNA时有污染,则需要重新抽提RNA。此外,也可能是非特异性扩增引发该问题,可提高退火温度,少循环次数。电泳缓冲液时间太长,ph值和盐离子浓度明显改变、电泳时电压太高、电泳液过久没换,电泳胶脏了等都可能引发该问题。如果不是由上述原因引起,则进一步检查加样量是否过大,制胶过程中胶孔是否制好,EB是否冲洗干净、模板中是否混有基因组DNA或蛋白等。也需考虑是否扩增的条件不合适。针对具体原因再采取相应的措施。
      
      3、梯度PCR仪产物何时需要用凝胶纯化,何时不需要?当凝胶分析扩增产物只有一条带时,则不需要使用凝胶纯化。当可见其他杂带时,则可能是积累了大量引物的二聚体,在克隆前需要做凝胶纯化。
      

      以上是关于梯度PCR仪常见问题及现场解决方案的介绍。

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